经典名方当归四逆汤指纹图谱及功效关联物质
摘要：目的基于指纹图谱及网络药理学对当归四逆汤（DangguiSiniDecoction，DSD）进行全过程质量控制和温经散寒、养血通脉功效关联物质预测分析。方法建立DSD物质基准对应实物的指纹图谱，匹配共有峰，进行共有峰的归属分析；基于可测性和可追溯性进行DSD活性成分的筛选，采用网络药理学构建“成分-靶点-通路”网络，预测DSD温经散寒、养血通脉功效关联物质。结果建立了DSD物质基准对应实物的指纹图谱，标定25个共有峰，指认了芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、肉桂酸、邻甲氧基桂皮醛、甘草酸、藁本内酯、细辛脂素9个色谱峰，相似度均＞0.90。根据各共有峰的归属分析，主要药效物质群可以从饮片到物质基准对应实物较为完整的传递，归属关系清晰明确；采用网络药理学对筛选出的9个活性成分进行“成分-靶点-通路”网络构建与分析，富集的通路中包括癌症信号通路、磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-proteinkinaseB，PI3K-Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路、瞬时受体电位（transientreceptorpotential，TRP）通道的炎性介质调节等，DSD的9个活性成分可能通过调节这些信号通路达到温经散寒、养血通脉的作用。结论建立了经典名方DSD的指纹图谱并对其进行归属分析，明确DSD的色谱峰归属，对经典名方DSD进行整体化、过程化的质量控制；并结合网络药理学发现DSD的9个活性成分具有传递性和溯源性，且与DSD温经散寒、养血通脉功效属性密切相关，可作为其潜在的功效关联物质，为DSD的进一步研究提供依据。
经典名方来源于古代医疗记载，是历代医药学家的经验总结，是我国医学宝库的重要组成部分。为了推动经典名方的开发研究，国家药品监督管理局于年3月发布了《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求（征求意见稿）》（以下简称《申报资料要求》）[1]，加强对经典名方的质量管理。当归四逆汤（DangguiSiniDecoction，DSD）出自东汉张仲景《伤寒论》[2]，原方由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通、大枣7味药组成，具有温经散寒、养血通脉等功效，主治血虚寒厥证。现代临床主要用于治疗痛经、糖尿病周围神经病变、类风湿性关节炎等疾病[3-6]。DSD的相关研究主要集中于临床应用方面，对质量控制方面的研究相对较少。本课题按照《申报资料要求》对经典名方DSD进行指纹图谱研究，并借助网络药理学构建DSD“成分-靶点-通路”网络，综合预测分析其潜在的功效关联物质。为全面控制和评价经典名方DSD的质量提供依据，为经典名方复方制剂的质量控制提供参考。1仪器与材料
1.1仪器
Waterse型高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA检测器和Empower工作站，美国Waters公司；ZYX型超纯水系统，南京汉隆实验器材有限公司；MS-DU型十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MG-H21S多功能电陶炉，广东美的生活电器制造有限公司；TDC型电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；H-W型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；砂锅，江西舒雅陶瓷有限公司。1.2试药
对照品阿魏酸（批号-15，质量分数99.4%）、桂皮醛（批号-，质量分数99.5%）、肉桂酸（批号-，质量分数98.8%）、芍药苷（批号-43，质量分数95.1%）、细辛脂素（批号-，质量分数.0%）、甘草苷（批号-08，质量分数95.0%）、甘草酸铵（批号-，质量分数96.2%），中国食品药品检定研究院；对照品藁本内酯，CAS：-01-0，质量分数＞98%，南京森贝伽生物科技有限公司；对照品芍药内酯苷，批号，质量分数%，上海诗丹德标准技术服务有限公司；对照品邻甲氧基桂皮醛，批号S28D9G，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司。乙腈，色谱纯，默克股份两合公司；甲醇，色谱纯，江苏汉邦科技有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为分析纯。DSD由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通和大枣7味药组成，均购自于道地产区或主产区，每味药共收集不少于3个产地，总批次不少于15批。经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥嫩枝、毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根和根茎、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎、木通科植物三叶木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.的干燥藤茎和鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实。本实验前期已按照《中国药典》年版项下各味药的检测方法和检测要求对药材进行检测，选出优质产地的药材：当归（甘肃岷县）、桂枝（广东肇庆）、白芍（安徽亳州）、细辛（辽宁新宾）、甘草（甘肃民勤）、三叶木通（陕西西安）、大枣（山东新泰）。按照《中国药典》年版及全国饮片炮制规范项下相关要求将药材炮制成15批饮片。经检测饮片均符合《中国药典》版项下相关规定。利用Excel中RANDBETWEEN函数生成随机数，将当归、桂枝、白芍、细辛、木通、炒甘草、大枣7味饮片的不同批次随机组合，DSD批次组合具体信息见表1。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为WatersXBridgeC18柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液；梯度洗脱：0～3min，5%乙腈；3～10min，5%～10%乙腈；10～15min，10%～12%乙腈；15～30min，12%～14%乙腈；30～35min，14%～17%乙腈；35～40min，17%～19%乙腈；40～50min，19%～25%乙腈；50～75min，25%～45%乙腈；75～90min，45%～70%乙腈；90～92min，70%～95%乙腈；92～95min，95%～5%乙腈；体积流量1.0mL/min；检测波长nm；柱温30℃；进样量20μL。2.2对照品溶液的制备
取各对照品适量，精密称定，加甲醇配制成含阿魏酸3.34μg/mL、藁本内酯2.20μg/mL、肉桂酸2.22μg/mL、邻甲氧基桂皮醛2.50μg/mL、芍药苷.20μg/mL、芍药内酯苷13.90μg/mL、细辛脂素3.77μg/mL、甘草苷17.61μg/mL、甘草酸34.16μg/mL的混合对照品溶液。2.3供试品溶液的制备
按照处方比例称取7味饮片量：当归9g，桂枝9g，白芍9g，细辛9g，炒甘草6g，木通6g，大枣24g。置砂锅中，加水mL，浸泡45min，以武火（W）煮沸后，调节火力至0W，开盖，保持微沸并煮至mL，趁热用目筛滤过，即得DSD物质基准对应实物。
取DSD物质基准对应实物3mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，称定质量，超声处理（功率W，频率40kHz）30min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4方法学考察
2.4.1精密度考察取DSD物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明各共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.18%，相对峰面积RSD值均小于3.30%，表明仪器精密度良好。
2.4.2重复性考察取DSD物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.91%，相对峰面积RSD值均小于3.82%，表明该方法的重复性良好，可用于DSD指纹图谱的检测。
2.4.3稳定性考察取DSD物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.90%，相对峰面积RSD值均小于2.08%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5DSD物质基准对应实物指纹图谱的建立及相似度评价
取23批DSD物质基准对应实物供试品溶液与对照品溶液按色谱条件进行测定，记录色谱图。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（A）软件，以S1为参照峰，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，得到23批DSD物质基准对应实物指纹图谱叠加图、共有模式图和混合对照品图，共确认25个色谱峰，指认9个色谱峰。结果见图1、2。与对照指纹图谱相比，23批DSD物质基准对应实物指纹图谱的相似度均＞0.90，表明DSD物质基准对应实物的相似度良好，主要物质群差异性小，制备工艺较为科学合理，形成的物质基准对应实物对照图谱能够作为衡量DSD物质基准对应实物的标准参照物，结果见表2。
2.6DSD物质基准对应实物指纹图谱共有峰的归属
按供试品制备方法分别制备单味饮片供试品溶液、缺单味饮片供试品溶液、和DSD物质基准对应实物供试品溶液。取DSD物质基准对应实物、单味饮片、缺单味饮片供试品溶液按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。分别将DSD物质基准对应实物、单味饮片、缺单味饮片供试品溶液的色谱图进行叠加比较，对DSD物质基准对应实物指纹图谱的色谱峰进行归属分析，结果见图3和表3。
根据图3和表3对DSD物质基准对应实物指纹图谱中各共有峰进行归属分析，DSD物质基准对应实物指纹图谱共确认25个色谱峰，均可以在原料饮片中找到明确归属。具体归属情况为4、22号峰归属于当归饮片；9、11、15号峰归属于桂枝饮片；2、3、7号峰归属于白芍饮片；1、4、19、20、23～25号峰归属于细辛饮片；5、6、8～10、12～14、16～18、21号峰归属于甘草；其中4号峰为当归、细辛所共有，9号峰为桂枝、甘草所共有。经对照品指认9个色谱峰，分别为2号峰芍药内酯苷、3号峰芍药苷、4号峰阿魏酸、5号峰甘草苷、11号峰肉桂酸、15号峰邻甲氧基桂皮醛、18号峰甘草酸、22号峰藁本内酯和23号峰细辛脂素，主要药效成分的指认率为36.0%。综上可知，DSD物质基准对应实物的物质群可清晰的追溯到饮片，且色谱峰归属明确，指认率较高。从色谱峰个数与峰强度看，甘草对指纹图谱的贡献最大，当归、桂枝、白芍和细辛对指纹图谱的贡献度相对较大，木通、大枣对指纹图谱的贡献较低。木通主要含三萜及其苷类，其指标性成分木通苯乙醇苷B在饮片炮制过程中损失严重，导致含量大幅度下降，在DSD煎煮过程中由饮片转移至水煎液的量极少，在此色谱条件下未检测出色谱峰。大枣主要成分为多糖和氨基酸类物质，水溶性大，含量较低，且大枣中指标性成分齐墩果酸、白桦脂酸等物质极性较小，由饮片转移至水煎液的量极少，在此色谱条件下不能检出色谱峰。因此，木通、大枣2味饮片，在本实验色谱条件下难以获得指纹图谱信息。
2.7基于网络药理学的DSD功效物质预测分析
2.7.1基于可测性和可追溯性的活性成分筛选根据文献研究，当归、桂枝共为DSD的君药，其中阿魏酸为药典项下当归的质量控制指标，藁本内酯为其挥发油主要成分；邻甲氧基桂皮醛是桂枝挥发油主成分之一，肉桂酸为非挥发油成分，受热较稳定，具有抗菌、利胆、抗突变、抗肿瘤、抗疲劳等药理作用[7]。白芍、细辛均为臣药，其中芍药苷为白芍的质量控制指标，具有镇痛、解除痉挛、保护脑血管等作用，芍药苷、芍药内酯苷等统称为芍药总苷，具有补血、抗抑郁等作用[8]；细辛主要活性成分为挥发油和木脂素类，细辛脂素为药典项下细辛的质量控制指标，具有镇痛、抗炎等作用[9-10]。甘草为佐药，其活性成分为黄酮类、三萜类，甘草苷具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用，甘草酸具有抗炎镇咳、免疫调节等作用，均为药典项下甘草含量测定的质量控制指标[11-12]。木通的主要成分为三萜、苷类成分，大枣的有效成分为多糖类。文献研究结合DSD的指纹图谱研究，以上类别中9个活性成分均能得到指认，且能够从饮片到物质基准对应实物进行传递。基于可测性和可追溯性，将这9个活性成分做为候选化合物。利用NCBI数据库（
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